In sechs Episoden begleitet LOL: Last One Laughing die Teilnehmer:innen bei ihrer Mission, ernst zu bleiben, während sie ihre Kolleg:innen mit Stand-Up, lustigen Performances, Improvisation und vollem Körpereinsatz zum Lachen bringen wollen. Alles wird von über 40 Kameras eingefangen und im Control Room überwacht. Die Regeln sind klar: Wer zweimal lacht, fliegt raus. Am Ende winken 50.000 Euro, die für einen guten Zweck gespendet werden.